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    Rosangela MARASCO

    Insegnamento di LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

    Corso di laurea in SCIENZE BIOLOGICHE

    SSD: BIO/19

    CFU: 1,00

    ORE PER UNITÀ DIDATTICA: 8,00

    Periodo di Erogazione: Secondo Semestre

    Italiano

    Lingua di insegnamento

    ITALIANO

    Contenuti

    Questo corso di laboratorio è un modulo del corso: "Laboratorio di metodologie biomolecolari, genetiche e microbiologiche". L'intero corso ha come scopo l'isolamento e il clonaggio di un gene umano. Durante il corso pratico di microbiologia gli studenti trasformeranno cellule di Escherichia coli con il plasmide contenente il gene clonato. I batteri contenenti il plasmide saranno selezionati su piastre selettive contenenti X-gal e IPTG. Lo screening bianco/blu delle colonie verrà utilizzato per individuare le cellule contenenti il plasmide ricombinante.

    Testi di riferimento

    Madigan, Martinko, Stahl, ClarK, BrocK, Biologia dei microrganismi 1° volume, Microbiologia generale, Casa editrice Pearson.
    Willey, Sherwood, Woolverton, Prescott, Microbiologia generale, Casa editrice McGraw-Hill.

    Obiettivi formativi

    Lo scopo di questo modulo è impartire conoscenze sui metodi utilizzati per isolare microrganismi ricombinanti. Si suppone che, dopo aver seguito questo corso, gli studenti abbiano capito:
    - le potenziali applicazioni dei microrganismi nel campo delle tecnologie del DNA ricombinante;
    - l'importante contributo microbico nei processi biotecnologici.
    Durante il corso, gli studenti riceveranno un adeguato training su alcune tecniche di laboratorio, particolarmente sulle procedure di lavorazione in condizioni di sterilità. Gli obiettivi del corso sono i seguenti:
    1) capire l'importanza di mantenere condizioni di sterilità nelle pratiche microbiologiche;
    2) imparare le tecniche ricombinanti e le procedure di trasformazione;
    3) capire come poter scrinare per un gene d'interesse e l'importanza di un marker e di un gene reporter negli esperimenti di biologia molecolare;
    4) imparare come calcolare l'efficienza di trasformazione.

    Metodologie didattiche

    Il corso consiste di 8 ore di attività pratiche in laboratorio. All'inizio del corso, gli esperimenti saranno spiegati e descritti e verrà fornito il materiale didattico. il docente è disponibile a ricevere gli studenti nei giorni indicati e in seguito a richiesta spedita via e-mail.

    Metodi di valutazione

    L'esame orale si baserà su domande riguardanti esperimenti eseguiti in laboratorio durante il corso. Gli studenti dovranno essere capaci di descrivere la competenza batterica e di spiegare le procedure di trasformazione per identificare i ricombinanti. Inoltre, saranno anche valutate le capacità di elaborazione e di esposizione degli studenti. La valutazione finale dell'esame verrà espressa in trentesimi.

    Programma del corso

    Durante il corso gli studenti impareranno a crescere e a trasformare le cellule batteriche. L'esperimento di laboratorio consisterà nel trasformare una coltura di cellule competenti di Escherichia coli con il plasmide ricombinante esprimente il gene d'interesse. Le cellule saranno rese competenti attraverso incubazione in cloruro di calcio (metodo heat-shock) e/o utilizzando il metodo di elettroporazione. In seguito ad heat shock e/o elettroporazione, le cellule trasformate verranno coltivate in terreno senza antibiotico per un breve periodo per permettere l'espressione del gene che conferisce resistenza all'antibiotico dal plasmide acquisito. Questo step migliorerà la vitalità cellulare e l'efficienza del clonaggio. Dopo trasformazione, le cellule verranno piastrate su piastre di Ty in presenza dell'appropriato antibiotico , di X-gal e di IPTG, per consentire l'identificazione dei trasformanti. La formazione delle colonie sulle piastre verrà esaminata il giorno successivo. Le colonie formate da cellule non ricombinanti appariranno blu, mentre quelle ricombinanti appariranno bianche. Le colonie bianche ricombinanti potranno essere facilmente prelevate e riinoculate. Infine, verrà anche calcolata l'efficienza di trasformazione.

    English

    Teaching language

    Italian

    Contents

    This laboratory course is a module of the course:" Laboratory of biomolecular, genetic and microbiological methodologies". The whole course aims to isolated and clone a human gene. During the microbiology practical course, students will transform Escherichia coli cells with the plasmid containing the cloned gene. Bacteria carrying the plasmid will be selected on selective plates in the presence of X-gal and IPTG. Blue/white screening of bacterial colonies will be used to check the cells containing the recombinant plasmid.

    Course objectives

    The aim of this module is to impart knowledge about the methods used to isolate recombinant microorganisms. After taking this laboratory course, students are supposed to know:
    - the potential applications of microorganisms in the recombinant DNA technology field;
    - the important microbial contribution to biotechnological processes.
    During this course, students will receive adequate training on some laboratory techniques, particularly on procedures for working in sterile conditions.
    The objectives of the course are the following:
    1) to understand the importance of the sterile techniques that are used to handle bacteria;
    2) to learn recombinant DNA techniques and transformation procedures;
    3) to understand how we can screen for a gene of interest and the importance of marker and reporter genes in molecular biology experiments;
    4) to learn how to calculate transformation efficiency.

    Teaching methods

    the course consists of 8 hours of practical activities in the laboratory. At the beginning of the course, the experiments will be explained and described and teaching material will be provided. The teacher is available to receive students on the indicated days and on request sent by e-mail.

    Evaluation methods

    Oral exam will be based on questions about experiments performed in the laboratory during the course. Students shall be able to describe bacterial competence and explain the transformation procedures for identifying recombinants. In addition, elaboration and exposition abilities of the students will be evaluated. The final evaluation of the exam will be expressed in thirtieths.

    Course Syllabus

    During the course, students will learn to grow and transform bacterial cells. The laboratory experiment will consist in transforming a culture of competent Escherichia coli cells with a recombinant plasmid expressing the gene of interest. Cells will be made competent by incubation in calcium chloride (heat shock method) and/or by electroporation method. Following heat shock and/or electroporation, transformed cells will be cultured in antibiotic-free liquid medium for a short period to allow the beginning of the expression of the antibiotic resistance gene from the acquired plasmid. This step will improve cell viability and cloning efficiency. After transformation, the cells will be plated on Ty agar in the presence of the appropriate antibiotic, X-gal and IPTG for identification and recovery of successful transformants. The culture plates will be examined the next day for colony formation. The colonies formed by non-recombinant cells, will appear blue in color, while the recombinant ones will appear white. The recombinant white colonies will be easily picked and cultured. Finally, the transformation efficiency will be also calculated.

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