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Genomi, trascrittomi e proteomi. Struttura degli acidi nucleici. Replicazione del DNA. Trascrizione genica e sintesi proteica. Regolazione dell’espressione genica. Metodiche del DNA ricombinante.

T. A. Brown – Genomi - EdiSES.
G. Capranico – Biologia Molecolare – EdiSES.
J. D. Watson - DNA Ricombinante – Zanichelli.
R. J. Reece – Analisi dei geni e genomi – EdiSES.

Conoscenza e Comprensione: l’insegnamento mira a fornire agli studenti una conoscenza approfondita inerente la struttura e le funzioni degli acidi nucleici (RNA e DNA) e a comprendere i processi biologici responsabili per la loro biosintesi. Gli studenti comprenderanno inoltre i principi teorici e le applicazioni laboratoriali delle tecniche estrattive degli acidi nucleici oltre che delle principali metodologie ricombinanti per l’analisi e la manipolazione degli acidi nucleici.
Capacità di Applicare la Conoscenza e la Comprensione: lo studente sarà in grado di applicare le conoscenze acquisite per programmare analisi biomolecolari per lo studio degli organismi viventi, sia in relazione alla loro fisiologia che ad aspetti patologici.
Autonomia di Giudizio: l’insegnamento favorisce lo sviluppo della capacità di valutare criticamente scenari e problemi complessi nel campo della biologia molecolare, consentendo agli studenti di formulare decisioni autonome basate su conoscenze teoriche e dati sperimentali.
Abilità Comunicative: lo studente svilupperà un linguaggio scientifico appropriato per descrivere gli acidi nucleici, il loro metabolismo e le tecniche di laboratorio. Sarà in grado di presentare oralmente risultati sperimentali e argomenti teorici in modo chiaro e coerente comunicando efficacemente in ambito interdisciplinare biologico-molecolare.
Capacità di Apprendimento: l’insegnamento promuove la capacità di apprendimento continuo, supportando l’autonomia decisionale e operativa nello studio e nell’approfondimento teorico-pratico delle conoscenze acquisite attraverso la consultazione di testi e letteratura scientifica, per affrontare in maniera efficace nuove problematiche del settore nonché proseguire gli studi in ambiti affini (biochimico, farmacologico, biotecnologico) con adeguato livello di autonomia.

Conoscenze e abilità fornite dal corso di Citologia ed Istologia (esame propedeutico). In particolare, è richiesta la conoscenza degli organuli cellulari e delle loro funzioni.

Il corso è articolato in 64 ore di lezioni frontali in aula. Le esercitazioni in laboratorio non sono previste perché si terranno nell’ambito del corso di Laboratorio di Metodologie Genetiche, Biomolecolari e Microbiologiche del terzo anno di corso. Le lezioni si avvarranno di programmi bioinformatici per l’analisi delle biomolecole oggetto di studio.

Il raggiungimento degli obiettivi dell’insegnamento è certificato mediante il superamento di un esame con valutazione espressa in trentesimi. L’esame consiste in una prova orale della durata di circa 30 minuti, volta ad accertare il livello di conoscenza teorica, la capacità di rielaborazione critica e la padronanza del linguaggio tecnico-scientifico. La prova si intende superata con un punteggio minimo di 18/30, come indicato di seguito:
<18 Non superato: lo studente non dimostra risultati coerenti con i descrittori di conoscenza e comprensione, applicazione, giudizio, comunicazione e capacità di apprendere.
18-21 Livello sufficiente: lo studente raggiunge i descrittori di base relativi alla conoscenza e comprensione dei contenuti fondamentali e mostra una prima capacità di applicazione in contesti semplici.
22-24 Livello pienamente sufficiente: lo studente soddisfa i descrittori di conoscenza e comprensione applicate, mostrando capacità di applicare concetti chiave correttamente e iniziare ad analizzare criticamente situazioni pertinenti ai temi dell’insegnamento.
25-26 Livello buono: lo studente dimostra autonomia di giudizio nel valutare e confrontare scenari pertinenti, applica conoscenze in modo efficace e comunica risultati con chiarezza, riflettendo competenze più consolidate.
27-29 Livello molto buono: lo studente soddisfa in modo avanzato i descrittori dei cinque ambiti, con padronanza dei contenuti, capacità di valutare criticamente casi complessi e abilità comunicative solide.
30 Livello eccellente: lo studente eccelle in tutti i descrittori di Dublino, con conoscenza approfondita, applicazione sicura e critica, giudizio autonomo, comunicazione efficace e capacità di apprendere in modo continuo e creativo. La lode può essere attribuita quando lo studente dimostra, oltre a quanto sopra, particolare originalità, approfondimento e innovazione, superando le aspettative standard.

La frequenza delle lezioni non è obbligatoria ma fortemente consigliata.
Il materiale didattico (dispense, presentazioni, eventuali approfondimenti) sarà reso disponibile sul sito Web del Dipartimento DISTABIF.
Il docente è disponibile per ricevimento studenti nei giorni indicati nella scheda dell’insegnamento e, su richiesta, anche in altri momenti concordabili via email.

CONCETTI DI BASE. Campo di studio della biologia molecolare. Dogma centrale della biologia. Genomi, trascrittomi e proteomi.

CRISTALLOGRAFIA AI RAGGI X E MODELLISTICA MOLECOLARE. Cristallizzazione di una biomolecola. Diffrazione dei raggi X. Mappe di densità elettronica. Modelli molecolari a nastro. Modelli basati sui raggi di van der Waals. Superfici accessibili al solvente e potenziali elettrostatici superficiali. Consultazione della Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/) per la ricerca delle coordinate atomiche di biomolecole. Uso del programma PDBViewer (http://us.expasy.org/spdbv/) per l’analisi della struttura tridimensionale di macromolecole biologiche.

STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI. Basi puriniche e pirimidiniche. Nucleosidi e nucleotidi. Legame fosfodiestereo e struttura primaria. Struttura secondaria del DNA. Parametri strutturali del DNA B e DNA A. Struttura secondaria e terziaria degli RNA.

REPLICAZIONE DEI GENOMI A DNA. Esperimento di Meselson e Stahl. Caratteristiche delle DNA polimerasi. Frammenti di Okazaki. Replicazione in E. coli: primasi, DNA polimerasi III, DNA polimerasi I, DNA ligasi. La replicazione del DNA cromosomale eucariotico: DNA polimerasi alfa, DNA polimerasi delta, ribonucleasi H, endonucleasi FEN1. Replicazione del DNA mitocondriale umano. Struttura e funzioni della telomerasi.

SINTESI E MATURAZIONE DEGLI RNA CELLULARI. Caratteristiche delle RNA polimerasi DNA-dipendenti. Fasi di inizio, allungamento e terminazione della trascrizione in E. coli. Gli operoni. Struttura degli mRNA procariotici. RNA polimerasi eucariotiche e relativi promotori. Fasi di inizio e allungamento della trascrizione operata dalla RNA polimerasi II. Formazione del cappuccio. Terminazione della trascrizione e poliadenilazione. Introni e splicing. Splicing alternativo. RNA editing. Struttura degli mRNA eucariotici maturi. Il codice genetico.

REPLICAZIONE DEI GENOMI A RNA. Meccanismo di replicazione dei: virus a RNA a polarità positiva (flavivirus, picornavirus, retrovirus); virus a RNA a polarità negativa; virus a RNA a doppio filamento. Peculiarità degli hepadnavirus.

SINTESI PROTEICA. Struttura e funzioni degli RNA di trasporto. Amminoacilazione del tRNA. L’inizio della traduzione in procarioti ed eucarioti. La fase di allungamento della traduzione. La terminazione della traduzione. Il vacillamento. Scivolamento della fase di lettura. Eccezioni all’universalità del codice genetico.

INTERPRETAZIONE DI UNA SEQUENZA GENOMICA. Struttura tipica dei geni codificanti procariotici ed eucariotici. Schemi di lettura aperti (ORF). Analisi di una sequenza nucleotidica per l'identificazione degli elementi tipici di un gene codificante eucariotico.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA. Regolazione dell’inizio della trascrizione nei procarioti: controllo costitutivo e controllo regolativo. Il controllo dell’inizio della trascrizione negli eucarioti. Fattori trascrizionali generali, attivatori, repressori e mediatori. Geni housekeeping e geni tessuto-specifici. Motivi strutturali delle proteine che legano il DNA: elica-giro-elica, dito di zinco, cerniera di leucina. Effetti della struttura cromatinica sull’espressione genica: acetilazione e deacetilazione degli istoni; metilazione del DNA. Silenziamento genico mediato dai microRNA.

METODI DI BASE PER L’ANALISI DEGLI ACIDI NUCLEICI. Spettri UV e quantizzazione spettrofotometrica degli acidi nucleici. Denaturazione termica del DNA e determinazione della temperatura di fusione. Predizione della Tm: effetto del contenuto in GC e della forza ionica. Rinaturazione del DNA. Precipitazione degli acidi nucleici con sali ed etanolo. Elettroforesi su gel di agarosio. Sequenziamento del DNA.

METODICHE DEL DNA RICOMBINANTE. Isolamento dell’RNA. Selezione del poli(A)+ RNA. Northern blot. Nick translation. Random priming. Clonaggio del DNA. Enzimi di restrizione. DNA ligasi. Vettori di clonaggio plasmidici. Vettori di espressione. Clonaggio del DNA nel fago lambda. Isolamento del DNA genomico. Southern blot. Marcatura di sonde oligonucleotidiche. Costruzione di una genoteca. Screening di una genoteca. Costruzione e screening di un archivio di cDNA. Reazione a catena della DNA polimerasi. Pregi e limiti della PCR. Clonaggio di un gene mediante PCR. RT-PCR. Applicazioni della PCR in campo diagnostico. DNA fingerprinting. Assemblaggio di geni sintetici. Mutagenesi sito-diretta. Mutagenesi a cassetta. Mutagenesi per estensione del primer. Mutagenesi mediante PCR.

Italian

Genomes, transcriptomes, and proteomes. Structure of nucleic acids. DNA replication. Gene transcription and protein synthesis. Regulation of gene expression. Recombinant DNA technologies.

T. A. Brown – Genomi - EdiSES.
G. Capranico – Biologia Molecolare – EdiSES.
J. D. Watson - DNA Ricombinante – Zanichelli.
R. J. Reece – Analisi dei geni e genomi - EdiSES

Knowledge and Understanding: The course aims to provide students with an in-depth knowledge of the structure and functions of nucleic acids (RNA and DNA) and to understand the biological processes responsible for their biosynthesis. Students will also acquire an understanding of the theoretical principles and laboratory applications of nucleic acid extraction techniques, as well as the main recombinant methodologies for the analysis and manipulation of nucleic acids.
Applying Knowledge and Understanding: The student will be able to apply the acquired knowledge to design biomolecular analyses for the study of living organisms, both in relation to their physiology and to pathological aspects.
Making Judgements: The course fosters the development of the ability to critically evaluate complex scenarios and problems in the field of molecular biology, enabling students to make independent decisions based on theoretical knowledge and experimental data.
Communication Skills: The student will develop appropriate scientific language to describe nucleic acids, their metabolism, and laboratory techniques. They will be able to present experimental results and theoretical topics orally in a clear and coherent manner, communicating effectively in an interdisciplinary biomolecular context.
Learning Skills: The course promotes continuous learning ability, supporting independent decision-making and operational autonomy in both theoretical and practical study of the acquired knowledge through the consultation of textbooks and scientific literature. This will enable students to effectively address new challenges in the field and to pursue further studies in related areas (biochemistry, pharmacology, biotechnology) with an adequate level of autonomy.

Knowledges and skills furnished by the course of Cytology and Histology (propaedeutic exam). It is required the knowledge of cell organelles and their function.

64 hours of lessons will be held in a classroom. Laboratory practice is not required because it will be part of the third-year course of “Laboratorio di Metodologie Genetiche, Biomolecolari e Microbiologiche”. Bioinformatics software will be used to analyze the structure of biomolecules.

The achievement of the course learning objectives is certified by passing an examination graded on a scale of thirty. The exam consists of an oral test lasting approximately 30 minutes, aimed at assessing the level of theoretical knowledge, critical thinking skills, and mastery of technical-scientific language. The exam is considered passed with a minimum score of 18/30, as detailed below:
<18 – Fail: the student does not demonstrate results consistent with the descriptors of knowledge and understanding, application, judgment, communication, and learning skills.
18–21 – Satisfactory level: the student meets the basic descriptors related to knowledge and understanding of fundamental content and shows an initial ability to apply concepts in simple contexts.
22–24 – Fully satisfactory level: the student meets the descriptors of applied knowledge and understanding, demonstrating the ability to correctly apply key concepts and begin to critically analyze situations relevant to the course topics.
25–26 – Good level: the student demonstrates independent judgment in evaluating and comparing relevant scenarios, applies knowledge effectively, and communicates results clearly, reflecting more consolidated skills.
27–29 – Very good level: the student meets the descriptors across all five areas at an advanced level, with strong command of the content, the ability to critically evaluate complex cases, and solid communication skills.
30 – Excellent level: the student excels in all Dublin descriptors, with in-depth knowledge, confident and critical application, independent judgment, effective communication, and the ability to learn continuously and creatively.
Honours (with distinction) may be awarded when the student demonstrates, in addition to the above, particular originality, depth of analysis, and innovation, exceeding standard expectations.

Attendance of the lessons is not compulsory but is strongly recommended.
Teaching materials (handouts, presentations, and any additional resources) will be made available on the Web site of DISTABIF.
The instructor is available for student office hours on the days indicated in the course syllabus and, upon request, at other times that can be arranged via email.

BASIC CONCEPTS. Field of study of Molecular Biology. Central dogma of biology. Genomes, transcriptomes, and proteomes.

X-RAY CRYSTALLOGRAPHY AND MOLECULAR MODELING. Crystallization of a biomolecule. X-ray diffraction. Electron density maps. Ribbon models. Van der Waals models. Water-accessible surface area and electrostatic potential. Search of Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/) to download the atomic coordinates of biomolecules. Use of the Molecular modeling program PDBViewer (http://us.expasy.org/spdbv/) to analyze the three-dimensional structure of macromolecules.


STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS. Purines and pyrimidines. Nucleosides and nucleotides. Phosphodiester bond and primary structure of nucleic acids. Secondary structure of DNA. Structural parameters of type-A and -B DNA. Secondary and tertiary structure of RNA.

DNA GENOMES REPLICATION. Experiment of Meselson and Stahl. Properties of DNA Polymerases. Okazaki fragments. DNA replication in E. coli: primase, DNA polymerase III, DNA polymerase I, DNA ligase. Eukaryotic chromosomal DNA replication: DNA polymerase alfa, DNA polymerase delta, ribonuclease H, FEN1 endonuclease. Replication of human mitochondrial DNA. Structure and function of telomerase.


TRANSCRIPTION AND MATURATION OF CELLULAR RNAs. Properties of DNA-dependent RNA Polymerases. Transcription in E. coli. Operons. Structure of prokaryotic mRNA. Eukaryotic RNA polymerases and their promoters. Transcription by RNA polymerase II. Capping. Polyadenylation. Introns and splicing. Alternative splicing. RNA editing. Structure of eukaryotic mRNA. Genetic code.



REPLICATION OF RNA GENOMES. Replication of: positive strand RNA viruses (flavivirus, picornavirus, retrovirus); negative strand RNA viruses; double strand RNA viruses. Peculiarities of hepadnavirus.

PROTEIN SYNTHESIS. Structure and functions of transfer RNA. Aminoacylation of tRNA. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. The elongation phase of translation. Termination of translation. tRNA wobble. Reading frame shifting. Exceptions to the universality of the genetic code.


INTERPRETATION OF A GENOMIC DNA SEQUENCE. Typical structure of prokaryotic and eukaryotic coding genes. Open reading frames (ORF). Analysis of a nucleotide sequence for the identification of typical elements of a eukaryotic protein-coding gene.

REGULATION OF GENE EXPRESSION. Regulation of transcription initiation in prokaryotes: constitutive control and regulative control. Control of transcription initiation in eukaryotes. General transcription factors, activators, repressors, and mediators. Housekeeping genes and tissue-specific genes. Structural motifs of DNA-binding proteins: helix-turn-helix, zinc finger, leucine zipper. Effects of chromatin structure on gene expression: histone acetylation and deacetylation; DNA methylation. Gene silencing mediated by microRNAs.

BASIC METHODS FOR NUCLEIC ACID ANALYSIS. UV spectra and spectrophotometric quantification of nucleic acids. Thermal denaturation of DNA and determination of melting temperature. Prediction of Tm: effect of GC content and ionic strength. DNA renaturation. Precipitation of nucleic acids with salts and ethanol. Agarose gel electrophoresis. DNA sequencing.
RECOMBINANT DNA TECHNIQUES. RNA isolation. Selection of poly(A)+ RNA. Northern blot. Nick translation. Random priming. DNA cloning. Restriction enzymes. DNA ligase. Plasmid cloning vectors. Expression vectors. DNA cloning in lambda phage. Isolation of genomic DNA. Southern blot. Labeling of oligonucleotide probes. Construction of a genomic library. Screening of a genomic library. Construction and screening of a cDNA library. Polymerase chain reaction (PCR). Advantages and limitations of PCR. Gene cloning by PCR. RT-PCR. Applications of PCR in diagnostics. DNA fingerprinting. Assembly of synthetic genes. Site-directed mutagenesis. Cassette mutagenesis. Primer extension mutagenesis. PCR-based mutagenesis.