ITALIANO

Questa esperienza di laboratorio è un modulo del corso pratico: "Laboratorio di metodologie biomolecolari, genetiche e microbiologiche". L'intero insegnamento ha come scopo l'isolamento e il clonaggio di un gene umano. Durante l'esperienza di microbiologia gli studenti trasformeranno cellule di Escherichia coli con il plasmide contenente il gene clonato. I batteri contenenti il plasmide saranno selezionati su piastre selettive contenenti X-gal e IPTG. Lo screening bianco/blu delle colonie verrà utilizzato per individuare le cellule contenenti il plasmide ricombinante.

Testo obbligatorio:Madigan M.T., Bender K., Buckley D.H., Sattley W.M. e Stahl D.A. BrocK, Biologia dei microrganismi :Microbiologia, generale, ambientale e industriale.Casa editrice Pearson.Febbraio 2022, pagine 903.
Testo consigliato: Willey J.M.,Sandman K.M. e Wood D.H. Prescott, Microbiologia generale, Casa editrice McGraw-Hill Education, Giugno 2025, pagine 646.

Conoscenza e comprensione:

Lo scopo di questo modulo è impartire conoscenze sui metodi utilizzati per isolare microrganismi ricombinanti. Si suppone che, dopo aver seguito questa esperienza di laboratorio, gli studenti abbiano capito:
- le potenziali applicazioni dei microrganismi nel campo delle tecnologie del DNA ricombinante;
- l'importante contributo microbico nei processi biotecnologici;
- come poter scrinare per un gene d'interesse ed applicare le relative procedure;
- l'importanza di un marker e di un gene reporter negli esperimenti di biologia molecolare.

Capacità di applicare la conoscenza e la comprensione:

Gli studenti saranno in grado di applicare le conoscenze teoriche di Microbiologia alle pratiche di laboratorio, imparando ad eseguirle in sicurezza e in condizioni sterili. In particolare gli studenti impareranno a mettere in pratica protocolli di trasformazione batterica e a selezionare ed analizzare le colonie trasformate.

Autonomia di giudizio:

Al termine dell’esperienza di laboratorio gli studenti acquisiranno la capacità di interpretare i risultati ottenuti, di valutarli criticamente, nonché di identificare eventuali errori di procedura.

Abilità comunicative:

L’esperienza di laboratorio svilupperà negli studenti competenze comunicative relative alla capacità di descrivere e documentare criticamente i risultati degli esperimenti, utilizzando terminologia tecnica adeguata. Inoltre gli studenti acquisiranno la capacità di lavorare in gruppo, condividendo procedure e le problematiche sperimentali.

Capacità di apprendimento:

Gli studenti acquisiranno capacità di apprendimento che consentirà loro di essere in grado di consultare e comprendere alcune metodologie microbiologiche riportate in letteratura e di aggiornarsi su quelle emergenti. Inoltre il docente li guiderà a sviluppare una modalità autonoma di esecuzione dei protocolli e al riconoscimento dei limiti e delle potenzialità delle diverse tecniche microbiologiche.

Conoscenze delle norme generali di sicurezza in laboratorio.
Conoscenze dei principi fondamentali di Microbiologia teorica.

Il corso consiste di 8 ore di attività pratiche in laboratorio. All'inizio dell'insegnamento, gli esperimenti saranno spiegati e descritti. Le slide che illustrano la base teorica dell'esperimento saranno caricate sul sito DISTABIF. E' richiesta il 70% di frequenza in laboratorio.

L'esame orale si baserà su domande riguardanti esperimenti eseguiti in laboratorio. Gli studenti dovranno essere capaci di descrivere la competenza batterica e di spiegare le procedure di trasformazione per identificare i ricombinanti. Inoltre, saranno anche valutate le capacità di elaborazione e di esposizione degli studenti. La valutazione finale dell'esame seguirà i seguenti criteri:
<18 Non superato: lo studente non dimostra risultati coerenti con i descrittori di conoscenza e comprensione, applicazione, giudizio, comunicazione e capacità di apprendere.
18-21 Livello sufficiente: lo studente raggiunge i descrittori di base relativi alla conoscenza e comprensione dei contenuti fondamentali e mostra una prima capacità di applicazione in contesti semplici.
22-24 Livello pienamente sufficiente: lo studente soddisfa i descrittori di conoscenza e comprensione applicate, mostrando capacità di applicare concetti chiave correttamente e iniziare ad analizzare criticamente situazioni pertinenti ai temi dell’insegnamento.
25-26 Livello buono: lo studente dimostra autonomia di giudizio nel valutare e confrontare scenari pertinenti, applica conoscenze in modo efficace e comunica risultati con chiarezza, riflettendo competenze più consolidate.
27-29 Livello molto buono: lo studente soddisfa in modo avanzato i descrittori dei cinque ambiti, con padronanza dei contenuti, capacità di valutare criticamente casi complessi e abilità comunicative solide, evidenziate in elaborati e presentazioni.
30 Livello eccellente: lo studente eccelle in tutti i descrittori di Dublino, con conoscenza approfondita, applicazione sicura e critica, giudizio autonomo, comunicazione efficace e capacità di apprendere in modo continuo e creativo, producendo lavori di elevata qualità sia nella presentazione sia nelle prove scritte/orali. La lode può essere attribuita quando lo studente dimostra, oltre a quanto sopra, particolare originalità, approfondimento e innovazione nell’elaborato e nella presentazione, superando le aspettative standard.

Il docente è disponibile a ricevere gli studenti nei giorni mercoledì e giovedì dalle 12 alle 14 nel suo studio e, su richiesta anche in remoto

Durante il corso gli studenti impareranno a crescere e a trasformare le cellule batteriche. L'esperimento di laboratorio consisterà nel trasformare una coltura di cellule competenti di Escherichia coli con il plasmide ricombinante esprimente il gene d'interesse. Le cellule saranno rese competenti attraverso incubazione in cloruro di calcio (metodo heat-shock) e/o utilizzando il metodo di elettroporazione. In seguito ad heat shock e/o elettroporazione, le cellule trasformate verranno coltivate in terreno senza antibiotico per un breve periodo per permettere l'espressione del gene che conferisce resistenza all'antibiotico dal plasmide acquisito. Questo step migliorerà la vitalità cellulare e l'efficienza del clonaggio. Dopo trasformazione, le cellule verranno piastrate su piastre di Ty in presenza dell'appropriato antibiotico , di X-gal e di IPTG, per consentire l'identificazione dei trasformanti. La formazione delle colonie sulle piastre verrà esaminata il giorno successivo. Le colonie formate da cellule non ricombinanti appariranno blu, mentre quelle ricombinanti appariranno bianche. Le colonie bianche ricombinanti potranno essere facilmente prelevate e riinoculate. Infine, verrà anche calcolata l'efficienza di trasformazione.

Italian

This laboratory experience is a module of the practical course: “Laboratory of biomolecular, genetic, and microbiological methodologies.” The overall course aims at the isolation and cloning of a human gene.
During the microbiology experiment, students will transform Escherichia coli cells with a plasmid containing the cloned gene. Bacteria carrying the plasmid will be selected on selective plates containing X-gal and IPTG. Blue-white colony screening will be used to identify cells containing the recombinant plasmid.

Required text: Madigan M.T., Bender K., Buckley D.H., Sattley W.M. e Stahl D.A. BrocK, Biologia dei microrganismi :Microbiologia, generale, ambientale e industriale. Pearson publishing house.February 2022, pages 903.
Recommended text: Willey J.M.,Sandman K.M. e Wood D.H. Prescott, Microbiologia generale,
McGraw-Hill Education publishing house, June 2025, pages 646.

Knowledge and understanding:

The aim of this module is to provide knowledge about the methods used to isolate recombinant microorganisms. It is expected that, after completing this laboratory experience, students will understand:

the potential applications of microorganisms in the field of recombinant DNA technologies;
the important microbial contribution to biotechnological processes;
how to screen for a gene of interest and apply the relevant procedures;
the importance of a marker and a reporter gene in molecular biology experiments.

Ability to apply knowledge and understanding:

Students will be able to apply theoretical knowledge of Microbiology to laboratory practices, learning to perform them safely and under sterile conditions. In particular, students will learn how to carry out bacterial transformation protocols and how to select and analyze transformed colonies.

Autonomy of judgment:

At the end of the laboratory experience, students will acquire the ability to interpret the results obtained, evaluate them critically, and identify possible procedural errors.

Communication skills:

The laboratory experience will develop students’ communication skills related to the ability to describe and critically document experimental results using appropriate technical terminology. In addition, students will gain the ability to work in groups, sharing procedures and experimental challenges.

Learning skills:

Students will acquire learning skills that will enable them to consult and understand microbiological methodologies reported in the literature and to keep up to date with emerging ones. Furthermore, the instructor will guide them in developing an autonomous approach to protocol execution and in recognizing the limitations and potential of different microbiological techniques.

Knowledge of general laboratory safety regulations.
Knowledge of fundamental principles of theoretical Microbiology.

The course consists of 8 hours of practical laboratory activities. At the beginning of the course, the experiments will be explained and described. The slides illustrating the theoretical basis of the experiment will be uploaded to the DISTABIF website. A 70% attendance in the laboratory is required

Oral exam will be based on questions about experiments performed in the laboratory. Students shall be able to describe bacterial competence and explain the transformation procedures for identifying recombinants. In addition, elaboration and exposition abilities of the students will be evaluated.
The final assessment of the exam will follow the following criteria:
<18 Not passed: the student does not demonstrate results consistent with the descriptors of knowledge and understanding, application, judgment, communication, and learning ability.

18–21 Sufficient level: the student achieves the basic descriptors related to knowledge and understanding of fundamental content and shows an initial ability to apply it in simple contexts.

22–24 Fully sufficient level: the student meets the descriptors of applied knowledge and understanding, showing the ability to correctly apply key concepts and begin to critically analyze relevant situations related to the course topics.

25–26 Good level: the student demonstrates autonomy of judgment in evaluating and comparing relevant scenarios, applies knowledge effectively, and communicates results clearly, reflecting more consolidated skills.

27–29 Very good level: the student meets the descriptors of the five areas at an advanced level, with mastery of content, the ability to critically evaluate complex cases, and strong communication skills, as evidenced in written assignments and presentations.

30 Excellent level: the student excels in all Dublin descriptors, with in-depth knowledge, secure and critical application, independent judgment, effective communication, and the ability to learn continuously and creatively, producing high-quality work both in presentations and in written/oral exams. Honors (lode) may be awarded when the student demonstrates, in addition to the above, particular originality, depth, and innovation in the work and presentation, exceeding standard expectations.

The teacher is available to meet students in the office on Wednesdays and Thursdays from 12 a.m. to 14 p.m., and remotely upon request.

During the course, students will learn to grow and transform bacterial cells. The laboratory experiment will consist in transforming a culture of competent Escherichia coli cells with a recombinant plasmid expressing the gene of interest. Cells will be made competent by incubation in calcium chloride (heat shock method) and/or by electroporation method. Following heat shock and/or electroporation, transformed cells will be cultured in antibiotic-free liquid medium for a short period to allow the beginning of the expression of the antibiotic resistance gene from the acquired plasmid. This step will improve cell viability and cloning efficiency. After transformation, the cells will be plated on Ty agar in the presence of the appropriate antibiotic, X-gal and IPTG for identification and recovery of successful transformants. The culture plates will be examined the next day for colony formation. The colonies formed by non-recombinant cells, will appear blue in color, while the recombinant ones will appear white. The recombinant white colonies will be easily picked and cultured. Finally, the transformation efficiency will be also calculated.