ITALIANO

Tecnologie biomolecolari avanzate e applicazioni: Principali metodiche per la biologia sintetica (Design e produzione di costrutti di DNA; Vettori di espressione). Principali metodiche per lo studio dell’espressione e della funzione dei geni (Modelli murini; Crispr-Cas9; RNAi). Metodi per lo studio dell'interazione tra acidi nucleici e proteine. Controllo trascrizionale dell’espressione genica in eucarioti: modulazione della struttura cromatinica, fattori trascrizionali. Controllo post-trascrizionale dell’espressione genica: maturazione dell’mRNA; controllo della traduzione; RNA silencing. Controllo dell’attività delle proteine. Biologia e Biotecnologie dell'RNA: tipi di RNA; biogenesi; funzioni. Applicazioni in ambito diagnostico e terapeutico. Esercitazione di Laboratorio di Biologia Molecolare: Espressione eterologa dell’oncogene K-Ras.

1- Alberts B., Johnson A. et al. -Biologia Molecolare della cellula- Quarta edizioneZanichelli
2- Appunti dalle lezioni e slide delle lezioni sul sito web del Dipartimento.
3- Dispense per le esercitazioni pratiche
4-Articoli scientifici forniti dal docente e discussi a lezione

Al termine del corso lo studente avrà acquisito: -Conoscenza dei principali meccanismi di controllo dell’espressione genica in eucarioti. -Conoscenza delle più avanzate tecnologie in ambito biomolecolare. -Capacità di studiare criticamente un fenomento biologico a livello moleclare, immaginando gli approcci spriementali utili per lo studio- - Capacità di consultare criticamente la letteratura scientifica - Attitudine a utilizzare la comprensione dei meccanismi molecolari per immaginare metodologie innovative

Conoscenze e abilità fornite dal corso di Biologia Molecolare

48 ore di lezioni frontali erogate dal docente in aula 2 ore: esercitazione di bioinformatica con l'ausilio di PC in aula 6 ore: esercitazioni di laboratorio svolte nel Laboratorio di Biologia Sperimentale Le frequenza alle esercitazioni non è obbligaoria ma fortemente consigliata per poter meglio assimilare le basi teoriche.

Prova orale. La prova orale si prefigge l'obiettivo di valutare non solo la comprensione dei singoli argomenti trattati, ma soprattutto la capacità di collegamento tra i vari argomenti del corso. In particolare sarà valutata la capacità di descrivere pathway molecolari alla base del controllo dell'espressione genica, in relazione agli approcci sperimentale utilizzati per chiarirne i dettagli molecolari e la rilevanza biologica.

Allo studente è data la possibilità di sostenere una prova di autovalutazione in itinere, dopo circa 2/3 delle lezioni e consistente nel discutere, anche con l'ausilio di un power point, un articolo scientifico fornito dal docente e attinente al programma svolto. Lo studente potrà avvalersi del materiale didattico (dispense e slides) pubblicate sul sito web del Dipartimento. Il docente è disponibile per ricevimento studenti nei giorni indicati, ma anche su richiesta inoltrata via email.

Tecnologie biomolecolari avanzate e applicazioni: Principali metodiche per la biologia sintetica. Design e produzione di costrutti di DNA: principi e applicazioni. Vettori per espressione in procarioti e in eucarioti: principi generali e applicazioni. Produzione di vaccini ricombinanti: vaccini subunità, vaccini peptidici, vaccini vettori, vaccini a RNA. Trasfezioni. Principali metodi di trasferimento di acidi nucleici in cellule di mammifero per l’espressione transitoria o stabile. Principali metodiche per lo studio dell’espressione e della funzione dei geni. RT-qPCR e applicazioni. Ibridazione in situ. Cenni introduttivi a microarray e RNAseq. Approcci in vivo mediante l’utilizzo di modelli murini: “gene trap”; “enhancer trap”; ablazione cellulare; topi transgenici; knock-in, knock-out, sistema Cre-loxP, knock-out condizionale. L’editing genomico mediante il sistema CRISPR/CAS9. Il silenziamento genico mediato da RNA. Metodi per lo studio dell’interazione DNA/proteina, proteina/proteina, RNA proteina. EMSA. Cromatografie di affinità. Immunoprecipitazione della cromatina. RIP. Two Hybrid system. Meccanismi molecolari di controllo dell’espressione genica in eucarioti: Concetti introduttivi. Meccanismi di Controllo trascrizionale. Stato della cromatina e sua dinamicità. Codice istonico. Interruttori genetici: sequenze di DNA consensus, proteine regolatrici dei geni, modalità di funzionamento, risposta a segnali extracellulari. Isolatori. Metilazione del DNA: DNA metiltrasferasi eucariotiche; metilazione de novo e di mantenimento; ruolo della metilazione; isole CpG; imprinting genomico. Meccanismi di Controllo post-trascrizionale. Controllo delle modificazioni dell’mRNA: attenuazione; regolazione dello splicing; regolazione del sito di taglio dell’estremità 3’; editing. Controllo del trasporto e della localizzazione dell’mRNA. Controllo della traduzione. IRES. Controllo della degradazione dell’mRNA. Il silenziamento genico mediato da RNA: significato biologico, meccanismo ed applicazioni. Meccanismi di Controllo dell’attività delle proteine. Fosforilazione/Defosforilazione; segnalazione per fosforilazione; segnalazione da parte di proteine che legano GTP. Degradazione: il proteosoma, meccanismi di controllo della degradazione; malattie da prioni. Biologia e Biotecnologie dell’RNA Tipi di RNA. Biogenesi e funzioni: funzione genomica, trascrizionale e post-trascrizionale, traduzionale, post-traduzionale, catalitica. RNA regulatory network: Concetti base ed esempi. Focus sul ruolo dell’RNA nel cancro. Applicazioni degli studi sull’RNA in ambito diagnostico. Applicazioni degli studi sull’RNA in ambito terapeutico. Esercitazione di Laboratorio. Espressione eterologa dell'oncogene K-Ras: Retrieve della sequenza dalla banche dati e design dei primer; Purificazione di RNA; RT-PCR; clonaggio in un vettore di espressione; trasformazione, primi step per la produzione dell’oncoproteina.

Italian

Advanced Biomolecular Technologies and Applications. Main techniques in synthetic biology (design and production of DNA constructs; expression vectors). Main techniques for studying gene expression and function (murine models; CRISPR-Cas9; RNA interference). Methods for analyzing nucleic acid–protein interactions. Transcriptional control of gene expression in eukaryotes: Chromatin structure modulation; transcription factors. Post-transcriptional control of gene expression: mRNA maturation; translational control; RNA silencing. Control of protein activity. RNA Biology and Biotechnology: Types of RNA; biogenesis; functions. Applications in diagnostics and therapeutics. Molecular Biology Laboratory Experience: Heterologous expression of the K-Ras oncogene.

1- Alberts B., Johnson A. et al. -Biologia Molecolare della cellula- Zanichelli
2- Slides of lessons on web site of Departement
3- Handouts for laboratory experiences
4-Scientific articles

At the end of the course, students will have acquired: -Knowledge of the main mechanisms regulating gene expression in eukaryotes. -Understanding of the most advanced technologies in the field of biomolecular sciences. -Ability to critically analyze a biological phenomenon at the molecular level, and to design suitable experimental approaches for its investigation. -Ability to critically consult and interpret scientific literature. -An attitude for applying knowledge of molecular mechanisms to envision innovative methodologies.

Knowledge and skills provided by the course of Molecular Biology

48 hours of in-class lectures delivered by the professor. 2 hours of bioinformatics practicals using computers in the classroom. 6 hours of laboratory practicals conducted in the Experimental Biology Laboratory. Attendance at the practical sessions is not mandatory, but it is strongly recommended in order to better assimilate the theoretical foundations.

Oral exam. The oral exam is designed to assess not only the understanding of individual topics covered in the course, but also the ability to make connections between different concepts. Particular emphasis will be placed on the student's ability to describe molecular pathways underlying the regulation of gene expression, with reference to the experimental approaches used to elucidate their molecular details and biological relevance.

Students will have the opportunity to take a self-assessment test during the course, approximately two-thirds of the way through the lectures. This will consist of a discussion, possibly supported by a PowerPoint presentation, of a scientific article provided by the professor and related to the topics covered in the course. Students may use the teaching materials (handouts and slides) published on the Department’s website. The professor is available for student office hours on the indicated days, and also upon request via email.

Advanced Biomolecular Technologies and Applications. Main techniques for synthetic biology: Design and production of DNA constructs: principles and applications. Vectors for expression in prokaryotes and eukaryotes: general principles and applications. Production of recombinant vaccines: subunit vaccines, peptide vaccines, vector-based vaccines, RNA vaccines. Transfections: Main methods for the transfer of nucleic acids into mammalian cells for transient or stable expression. Key techniques for studying gene expression and function. RT-qPCR and its applications. In situ hybridization. Introductory notes on microarrays and RNAseq. In vivo approaches using murine models: gene trap; enhancer trap; cell ablation; transgenic mice; knock-in, knock-out, Cre-loxP system, conditional knock-out. Genome editing using the CRISPR/Cas9 system. RNA-mediated gene silencing. Methods for studying DNA/protein, protein/protein, and RNA/protein interactions: EMSA. Affinity chromatography. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). RIP (RNA immunoprecipitation). Two-Hybrid system. Molecular Mechanisms Controlling Gene Expression in Eukaryotes: Introductory concepts. Transcriptional control mechanisms. Chromatin state and its dynamics. Histone code. Genetic switches: DNA consensus sequences, gene regulatory proteins, mechanisms of action, response to extracellular signals. Insulators. DNA methylation: eukaryotic DNA methyltransferases; de novo and maintenance methylation; role of methylation; CpG islands; genomic imprinting. Post-transcriptional control mechanisms. Control of mRNA modifications: attenuation; splicing regulation; 3' end cleavage site regulation; editing. Control of mRNA transport and localization. Translational control. IRES. Control of mRNA degradation. RNA-mediated gene silencing: biological significance, mechanism, and applications. Control of protein activity: Phosphorylation/Dephosphorylation; signal transduction via phosphorylation; signaling by GTP-binding proteins. Degradation: the proteasome, degradation control mechanisms; prion-related diseases. RNA Biology and Biotechnology: Types of RNA. Biogenesis and functions: genomic, transcriptional, post-transcriptional, translational, post-translational, and catalytic functions. RNA regulatory networks: basic concepts and examples. Focus on the role of RNA in cancer. Applications of RNA studies in diagnostics. Applications of RNA studies in therapeutics. Laboratory Experience: Heterologous expression of K-ras oncogene: retrieving the sequence from databases and primer design; RNA purification; RT-PCR; cloning into an expression vector; transformation, initial steps for oncoprotein production.